Kern- und Stäbchenstrukturen eines thermophilen Cyanobakteriums

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3389 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Cyanobakterien, Glaukophyten und Rhodophyten nutzen riesige, lichtsammelnde Phycobilisomen (PBSs), um Sonnenenergie einzufangen und an photosynthetische Reaktionszentren weiterzuleiten. PBS sind in ihrer Zusammensetzung und Struktur vielfältig und äußerst komplex, was für ein umfassendes Verständnis ihrer Funktion eine Herausforderung darstellt. Bisher wurden drei detaillierte Architekturen von PBSs mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) beschrieben: ein Hemiellipsoid-Typ, ein Block-Typ aus Rhodophyten und ein Cyanobakterien-Hemidiscoid-Typ. Hier berichten wir über Kryo-EM-Strukturen eines pentazylindrischen Allophycocyanin-Kerns und eines Phycocyanin-haltigen Stabs eines thermophilen cyanobakteriellen hemidiskoidalen PBS. Die Strukturen definieren die räumliche Anordnung von Proteinuntereinheiten und Chromophoren, die für die Entschlüsselung des Energieübertragungsmechanismus von entscheidender Bedeutung sind. Sie enthüllen, wie der pentazylindrische Kern gebildet wird, identifizieren wichtige Wechselwirkungen zwischen Linkerproteinen und den Bilin-Chromophoren und zeigen Wege für die unidirektionale Energieübertragung auf.

Cyanobakterien, Glaukophyten und Rhodophyten nutzen einen großen wasserlöslichen Lichtsammelkomplex namens Phycobilisom (PBS) zur Absorption von Sonnenenergie und zur Energieübertragung auf photosynthetische Membranproteine (Photosystem I und Photosystem II; PSI und PSII)1. PBS absorbieren hauptsächlich sichtbares Licht bei 490–650 nm, das PSI und PSII nur schwer absorbieren können (ausnahmsweise beherbergen Cyanobakterien, die Chlorophyll f enthalten, PBS, die Licht im nahen Infrarot absorbieren 2, 3) (Ergänzende Abbildung 1). PBS besteht aus Phycobiliproteinen (PBPs) wie Phycoerythrin, Phycoerythrocyanin, Phycocyanin (PC) und Allophycocyanin (APC). Baueinheiten der PBPs sind α- und β-Untereinheiten, die Globinfalten aufweisen und mehrere lineare Tetrapyrrol-Chromophore wie Phycoerythrobilin, Phycourobilin, Phycoviolobilin und Phycocyanobilin (PCB) beherbergen. Oligomere dieser α- und β-Untereinheiten interagieren mit nicht-chromophorylierten Linkerproteinen, um PC-Stäbchen im gesamten PBS-Komplex zu bilden. Es wurden fünf Arten der PBS-Strukturmorphologie beschrieben: Hemidiscoidal5,6,7, Hemiellipsoidal8, Blocktyp9, Stabtyp10,11,12,13 und Bündeltyp14. Hemidiskoidale PBS haben bizylindrische15,16, trizylindrische5 oder pentazylindrische Kerne3,17. Die Zusammensetzung der PBPs im Hinblick auf die Anzahl der Stäbchen, die Gesamtstruktur der PBSs und ihre Assoziation mit PSI und PSII werden durch die Verfügbarkeit von Licht und Nährstoffen reguliert11,18. Kürzlich wurden die dreidimensionalen (3D) Strukturen von drei Arten von PBS mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)19,20,21,22 analysiert und Einzelheiten ihrer trizylindrischen und pentazylindrischen Kerne und Energieübertragungswege enthüllt. Da PBS in ihrer Zusammensetzung und Struktur vielfältig und äußerst komplex sind, sind Struktur- und Funktionsanalysen von PBS in verschiedenen Arten für das umfassende Verständnis ihrer Wirkmechanismen von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus bilden diese Strukturen eine Grundlage für das Verständnis mehrerer Cyanobakterien-PBS und können zur Förderung der effizienten Nutzung von Sonnenenergie genutzt werden23,24,25.

Hier berichten wir über die Strukturen des pentazylindrischen APC-Kerns und des PC-Stabs des thermophilen Cyanobakteriums Thermosynechococcus vulcanus mit einer Auflösung von 3,7 Å bzw. 4,2 Å. Obwohl ihre Gesamtstrukturen der PBS-Struktur von Anabaena sp. PCC 7120 (im Folgenden als Nostoc 7120 bezeichnet), berichtet von Ref. 22 haben wir die Unterschiede in ihren inneren Strukturen beobachtet. Die Strukturen zeigten Unterschiede im hemidiskoidalen PBS verschiedener Spezies und liefern einen möglichen Mechanismus für die unidirektionale Anregungsenergieübertragung.

Das PBS von T. vulcanus NIES-2134 (im Folgenden als T. vulcanus bezeichnet) hat eine hemidiscoide Struktur mit einem pentazylindrischen APC-Kern und sechs PC-Stäben mit einem Gesamtmolekulargewicht von ~6 MDa22,26 (ergänzende Abbildung 2). Der Kern und die Stäbe bestehen aus α- (CpcA, ApcA, ApcD und ApcE) und β- (CpcB, ApcB und ApcF) Untereinheiten und ihre Grundeinheit ist ein αβ-Monomer27. PCBs werden über Thioetherbindungen kovalent an konservierte Cysteinreste in den α- und β-Untereinheiten gebunden28. Es wird angenommen, dass Linkerproteine im PBS nicht nur zur strukturellen Stabilität des PBS, sondern auch zur Anpassung des Energieniveaus der Chromophore beitragen29. Linkerproteine von T. vulcanus werden als Stablinker (LR; CpcC) klassifiziert; Stabterminal-Linker (LRT; CpcD); Stab-Kern-Linker (LRC; CpcG1, CpcG2 und CpcG4); Kernmembran-Linker (LCM; ApcE), die an die APC-Trimere der PBS-Kernzylinder binden; oder Kernlinker (LC; ApcC), die an den PBS-Kern binden. Wenn das PBS Licht absorbiert, wird die Anregungsenergie schnell (in der Größenordnung von Pikosekunden) auf Chromophore in Untereinheiten an der Membranoberfläche, sogenannte terminale Emitter (ApcE [LCM] und ApcD), und schließlich auf PSII und PSI30 übertragen. Es wurde über mehrere Röntgenkristallstrukturen von PCs und APCs aus T. vulcanus berichtet, die Ausgangspunkte für Diskussionen über mögliche Gesamtstrukturkonfigurationen und Mechanismen der internen Energieübertragung in PBSs31,32,33,34,35,36 bildeten. 37.

Der pentazylindrische APC-Kern (PBS-Kern) und der PC-Stab wurden aus PBS-Präparaten erhalten, gefolgt von einer Gradientenfixierungsbehandlung (GraFix)26,38 bzw. einer Phosphatpufferbehandlung mit niedriger Konzentration. Für die Kryo-EM-Bildgebung ist es vorzuziehen, hochkonzentrierte Stabilisatoren zu entfernen (in diesem Fall war der Stabilisator ein Phosphatpuffer); Dies fördert jedoch die Dissoziation der PC-Stäbchen vom PBS-Kern sowohl bei Rotalgen als auch bei Cyanobakterien, einschließlich T. vulcanus. Obwohl PC-Stäbchen im vorbereiteten PBS an den PBS-Kern gebunden waren, wurden die meisten PC-Stäbchen während der GraFix-Behandlung dissoziiert (ergänzende Abbildung 2). Zweidimensionale (2D) Mittelwerte mit negativ gefärbter EM zeigten, dass der Zylinder am Boden des vorbereiteten T. vulcanus-PBS drei APC-Trimere umfasst. Wie von Lit. berichtet. 22, die PC-Stäbchen in PBS aus Cyanobakterien sind erheblich weniger interaktiv als die in Rotalgen19 und die Vernetzungsbehandlung mit Glutaraldehyd zur Verhinderung der Dissoziation der PC-Stäbchen trug dazu bei, die Struktur des PBS-Kerns aufrechtzuerhalten. Allerdings lösten sich einige der PC-Stäbe vom PBS-Kern. Der Grund für die schwächere Wechselwirkung von PC-Stäbchen in Cyanobakterien-PBS im Vergleich zu Rotalgen-PBS liegt wahrscheinlich in den Unterschieden in der PBS-Morphologie. In Rotalgen-PBSs (Block- und Halbellipsoid-Typen) gibt es viele dicht gepackte Phycoerythrin (PE)-Stäbchen, was auf die Möglichkeit zahlreicher Wechselwirkungen zwischen den Stäbchen schließen lässt. Allerdings sind die PC-Stäbchen von Cyanobakterien-PBS (hemidiscoidaler Typ) fächerförmig angeordnet, was darauf hindeutet, dass zwischen den PC-Stäbchen weniger Wechselwirkungen bestehen als bei den PE-Stäbchen der Rotalgen-PBS. Der Unterschied in der Morphologie legt nahe, dass Cyanobakterien-PBS unter Bedingungen niedriger Phosphatpufferkonzentration anfälliger für die Dissoziation von PC-Stäbchen ist als Rotalgen-PBS.

Kryo-EM-Karten des PBS-Kerns und des PC-Stabs wurden mit einer Auflösung von 3,7 Å bzw. 4,2 Å rekonstruiert, basierend auf den Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskriterien (FSC) von 0,143 zwischen zwei Halbkarten (Ergänzungstabelle 1). Die Strukturmodelle wurden anhand der Karten verfeinert, wodurch die Auflösungen validiert wurden. ein FSC-Wert von 0,5 zwischen Modell und Karte: 3,8 Å (PBS-Kern) und 4,2 Å (PC-Stab); Q-Score39-basierte Schätzungen: 3,6 Å (Q = 0,49; PBS-Kern) und 4,0 Å (Q = 0,40; PC-Stab) (Ergänzende Abbildungen 3 und 4 und ergänzende Tabellen 1–3).

Der analysierte PBS-Kern von T. vulcanus zeigt eine hemidiscoide Struktur mit C2-Symmetrie, bestehend aus drei Zylindern (A, A' und B), zwei Zylindern (C und C') und einigen PC-Stäben, die mit dem PBS-Kern interagieren (Abb. 1). Die Gesamtstruktur des PBS-Kerns war der von Nostoc 71207,22 sehr ähnlich. Die strikte zweifache Symmetrie wurde im äußeren Teil der PC-Stäbe (Rb, Rb', Rt, Rt', Rs1, Rs1', Rs2 und Rs2')7 nicht eingehalten, da sich viele dieser Teile währenddessen wahrscheinlich vom Kern lösten Probenvorbereitung (siehe oben). Die Kryo-EM-Karte löst Teile der Stäbchen auf, die lokale Auflösung der entsprechenden Regionen liegt jedoch zwischen 7 Å und 20 Å (ergänzende Abbildung 3). Daher haben wir keine Modelle der Stäbe gebaut (Abb. 1c). Der PBS-Kern ist ein Superkomplex mit den Abmessungen 110 × 210 × 300 Å und besteht aus 38 ApcAs, 40 ApcBs, 6 ApcCs, 2 ApcDs, 2 ApcEs (LCMs), 2 ApcFs und 84 PCBs (Supplementary Abb. 5, Supplementary). Tabelle 4). Im anderen Cyanobakterien-PBS-Kern22 bestehen die A- und B-Zylinder jeweils aus vier APC-Trimeren, wohingegen der PBS-Kern von T. vulcanus drei APC-Trimere im A-Zylinder und vier APC-Trimere im B-Zylinder umfasst. ApcD wurde im vierten APC-Trimer des A-Zylinders der anderen Cyanobakterien-PBS identifiziert und dieses Trimer spielt eine wichtige Rolle bei der Energieübertragung von PBS auf photosynthetische Membranproteine22. Es wird davon ausgegangen, dass bei gleicher Anordnung von ApcD in den PBS der Cyanobakterien Synechococcus sp. PCC 7002 (im Folgenden als Synechococcus 7002 bezeichnet), Nostoc 7120 und T. vulcanus, dann sollte T. vulcanus PBS ein viertes APC-Trimer im A-Zylinder haben. Das vorbereitete PBS von T. vulcanus enthält jedoch ApcD, und 2D-Mittelwerte mit EM mit negativer Färbung bestätigten, dass der A-Zylinder aus drei APC-Trimeren bestand (ergänzende Abbildung 2a, c, d). Dies legt nahe, dass sich die Anordnung von ApcD in T. vulcanus-PBS von der von PBS in anderen Arten unterscheidet. Derzeit verstehen wir nicht genau, warum T. vulcanus drei statt vier APC-Trimere im A-Zylinder aufweist.

Kryo-EM-Karte des PBS-Kerns aus der Vorderansicht (a, c), der Seitenansicht (b, e, f) und der Unteransicht (d). c Es zeigt die Überlagerung der Kryo-EM-Karte und des verfeinerten PBS-Kernmodells. e Hier zeigt es die Struktur innerhalb des Rechtecks in a, vergrößert und um 90˚ gedreht. f Dies zeigt e um 180˚ gedreht. g Schematisches Modell des pentazylindrischen APC-Kerns (einschließlich Zylinder A (A'), B und C (C')) und PC-Stäben (Rb, Rb', Rt und Rt'). ApcE (LCM), das α, Reps 1–4 und Arms 1–3 enthält, ist rot dargestellt. PC-Stäbe, die das Modell nicht gebaut haben, sind durchscheinend dargestellt. Die PC-Stabmodelle wurden unter Bezugnahme auf die Kryo-EM-Karte in dieser Studie und die PBS-Struktur von Nostoc 71207 gezeichnet. h Schematisches Modell des PC-Stabs. CpcC (LR), CpcD (LRT) und CpcG (LRC) interagieren innerhalb der beiden PC-Hexamer. Die Identifizierung von ApcD ist vorläufig. ApcD wird in Klammern angezeigt (ApcD).

Der A-Zylinder besteht aus den α-Untereinheiten der Phycobiliproteine (ApcA, ApcD und ApcE [LCM]), den β-Untereinheiten der Phycobiliproteine (ApcB und ApcF) und ApcC (Lc). Der A (A')-Zylinder besteht aus drei APC-Trimeren (A1, A2 und A3) mit den Untereinheiten ApcD/ApcB und zwei ApcA/ApcB (A1); drei ApcA/ApcB (A2); und ApcE/ApcB, ApcA/ApcF bzw. ApcA/ApcB (A3) (Abb. 2a). Die elektrophoretische Analyse zeigt, dass ApcD in vorbereiteten PBS vorhanden ist (ergänzende Abbildung 2c)26, ApcD konnte jedoch aufgrund der begrenzten Auflösung in der Kryo-EM-Karte nicht identifiziert werden. Anschließend haben wir ApcD vorläufig einer Untereinheit zugeordnet, die in dieser Studie nicht als ApcA identifiziert werden konnte (im Strukturmodell [PDB-Code: 7VEA] haben wir jedoch ApcA anstelle von ApcD identifiziert) (ergänzende Abbildung 6). Der B-Zylinder besteht aus vier APC-Trimeren, bestehend aus ApcA und ApcB (B1, B2, B1' und B2'). Darüber hinaus interagiert LC mit einer Seite der A- und C-Zylinder, während es mit beiden Seiten des B-Zylinders interagiert. Der C-Zylinder besteht aus zwei APC-Trimeren, ApcA und ApcB, die einem halben B-Zylinder entsprechen.

ApcE (LCM) ist ein terminaler Emitter, der sich an der Membranoberfläche im A-Zylinder befindet und Energie an PSII überträgt. ApcE (LCM) besteht aus αLCM und eine seiner Domänen weist eine ähnliche Struktur wie ApcA auf, vier wiederholte Motive mit der Bezeichnung „Wiederholungen“ (Rep1–Rep4) und „Arme“ (Arm1–3), die die Motive verbinden. Rep1 interagiert mit ApcF, zwei ApcAs (α2 und α3) und einem ApcB (β1) in A1 (Abb. 2b). Obwohl die ApcEs (LCMs) der beiden Rotalgen-PBSs und Synechococcus 7002 PBS kein Rep4 enthalten, sind die quadratischen Mittelwertabweichungen (RMSDs) von Rep1–Rep4 in den ApcEs (LCMs) jeder Art gering und die Sequenz Die Identität von Rep1–Rep4 aus Cyanobakterien ist tendenziell hoch (Ergänzungstabelle 5). Dies deutet darauf hin, dass die Struktur und Funktion jedes Reps trotz der Artenunterschiede ähnlich ist.

a Anordnung der terminalen Emitter (αLCM von ApcE [LCM] und ApcD), ApcF und Linkerproteine (ApcE [LCM] und ApcCs). b Strukturen des APC-Trimers (A3) und Rep1 von ApcE (LCM) im A-Zylinder. c Strukturen der APC-Trimere A1 und A2, ApcC und Rep2 von ApcE (LCM) im A-Zylinder. d Strukturen der APC-Trimere B1 und B2, ApcC, Rep3 und Arm3 von ApcE (LCM) im B-Zylinder. e Struktur der APC-Trimere C1 und C2, ApcC und Rep4 von ApcE (LCM) im C'-Zylinder. f Überlagerung von vier Rep-Strukturen (Reps1–4). Gestrichelte Linien zeigen die α-Helixe in den Rep-Regionen. Rep1, grün; Rep2, rot; Rep3, blau; Rep4, Cyan.

In den kürzlich berichteten Strukturen von Rotalgen interagiert ApcC mit Rep1 von ApcE (LCM), während ApcC und (ApcD) möglicherweise mit Rep2 des PBS-Kerns von T. vulcanus interagieren, was darauf hindeutet, dass die Interaktion zwischen Untereinheiten im Kern ebenfalls unterschiedlich ist Spezies. Rep3 von ApcE (LCM) trägt zusammen mit ApcC zur Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion der beiden APC-Trimere im B-Zylinder bei. Arm3 erstreckt sich bis Rep4, das als Linkerdomäne des C-Zylinders dient. Rep4 interagiert mit ApcC auf die gleiche Weise wie Rep2 und Rep3, was bedeutet, dass jeder Zylinder im PBS-Kern ein ApcC enthält (Abb. 2c – e). Ein interessantes Merkmal von Reps1–4 in ApcE (LCM) ist, dass die Strukturen der α-Helix-Regionen ähnlich sind, während sich die Strukturen der Schleifenregionen unterscheiden (Abb. 2f). Die Sequenzidentität zwischen Reps ist nicht hoch (ergänzende Abbildung 7), was nicht nur darauf hindeutet, dass Reps1–4 die Struktur jedes Zylinders beibehalten, sondern auch, dass unterschiedliche Aminosäurereste in jedem Rep um PCB herum zur effizienten Übertragung absorbierter Lichtenergie beitragen könnten die Endemitter. Arm3, Rep4 von ApcE (LCM) und der C-Zylinder sind im PBS-Kern von Rotalgen19,20 oder Synechocystis6 nicht vorhanden, wohingegen diese Komponenten in etwa der Hälfte der Cyanobakterien vorhanden sind, wenn die ApcE (LCM)-Domänen der Phylogenetik zugeordnet werden Baum der wichtigsten Cyanobakterienarten (Ergänzende Abbildungen 8 und 9). Daher müssen der C-Zylinder, Rep4 und Arm3, die den C-Zylinder selbst unterhalten und bei vielen Algenarten, einschließlich Cyanobakterien, vorkommen, eine Schlüsselrolle bei der Lichtgewinnung spielen. ApcE (LCM) ist eines der wichtigsten Linkerproteine für die Energieübertragung auf PSII1. Die in dieser Studie beschriebene Struktur von T. vulcanus PBS bietet einen Ausgangspunkt für das Verständnis der Komponentenarchitektur und Organisationsnetzwerke für allgemeine Arbeitsmechanismen von PBS in der breiten Algengruppe.

Das Fehlen des „vierten APC-Trimers“ im A-Zylinder von T. vulcanus PBS kann auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass ApcC, das im APC-Trimer interagiert, nicht in der Lage ist, mit Rep1 in ApcE zu interagieren. Es gibt zwei Hauptkonformationstypen (Typ I und II) in ApcC des in Nostoc 7120 und Synechococcus 7002 vorhandenen PBS. ApcC, das mit Reps2–4 interagiert, ist Typ I, während ApcC, das mit Rep1 interagiert, Typ II ist (ergänzende Abbildung). 10). Die Strukturen von ApcC (Typ I und II) von Nostoc 7120 und Synechococcus 7002 sind ähnlich (RMSD: 0,78 [Typ I] und 0,74 [Typ II]). Im Gegensatz dazu ist in T. vulcanus PBS ApcC, das mit Reps3–4 interagiert, vom Typ I, ApcC, das mit Rep2 interagiert, ist jedoch weder Typ I noch II (d. h. Typ III). Der Vergleich der Typen II und III ergab eine unterschiedliche Anordnung der Schleifenregionen in ApcC (Reste 9–26, ergänzende Abbildung 10c) und einen etwas größeren RMSD zwischen den Typen I und III (1.7). Obwohl die Aminosäuresequenzen von Reps1–4 und ApcC in den drei Cyanobakterien ähnlich sind (ergänzende Abbildung 10d), kann die Umgebung von Rep2 in T. vulcanus PBS die Wechselwirkung von ApcC im Vergleich zu den anderen Cyanobakterien verändern. Dies deutet darauf hin, dass die Umgebung von Rep1 in T. vulcanus PBS keine ApcC-Interaktion zulässt und daher der „vierte APC-Trimer“ nicht in der Lage ist, mit Rep1 zu interagieren.

Die Anregungsenergie wird über Chromophore in den B- und C-Zylindern (C') auf die Endemitter (ApcE [LCM] und ApcD) übertragen, und die Energie wird schließlich auf PSII und PSI übertragen. T. vulcanus hat PCB als einzigen Chromophor, und es ist die Proteinumgebung um jeden Chromophor, die eng an der Übertragung der angeregten Energie auf die Endemitter beteiligt sein muss. Tatsächlich beeinflussen Aminosäurereste mit polaren/geladenen Gruppen die Absorptionsenergie von Pigmenten40.

Abbildung 3 zeigt jeden Zylinder, der den PBS-Kern bildet, die Chromophore im Kern und die Abstände zwischen den Chromophoren. Im Allgemeinen wird die Anregungsenergie zwischen nahen Paaren von Chromophoren, dh dem Donor (D) und dem Akzeptor (A), übertragen (Förster Resonance Energy Transfer; FRET)41,42. Der Energietransfer zwischen Chromophoren im PBS kann jedoch nicht allein durch den FRET-Mechanismus erklärt werden, da sowohl in PC als auch in APC photoangeregte Kohärenzsignale beobachtet wurden, die auf eine extonische Kopplung hinweisen43,44. Darüber hinaus haben neuere Experimente ein neues Merkmal offenbart, bei dem Anregungen während der Energieübertragung kohärent zwischen Donor- und Akzeptormolekülen geteilt werden45. Darüber hinaus deuten frühere Studien darauf hin, dass es zu einer exzitonischen Kopplung in irgendeiner Form kommen kann, selbst bei Abständen im Bereich von 20 Å bis 30 Å, was es dem PBS ermöglicht, Energie mit hoher Effizienz zu übertragen29,46. MacColl46 berichtete über eine excitonische Kopplung zwischen den beiden Chromophoren des APC-Trimers, die sich in der Nähe der Monomer-Monomer-Grenzfläche befinden, und diese starke Wechselwirkung induziert bei Exciton eine Rotverschiebung im Absorptionsspektrum. Obwohl Beweise beide Mechanismen stützen, deutet die ultraschnelle Fluoreszenz, die aus einer Reihe von Ansätzen resultiert, nun darauf hin, dass der excitonische Kopplungsmechanismus plausibler ist; Obwohl das in dieser Studie erhaltene Strukturmodell eine Interpretation der Anordnung und Ausrichtung der Chromophore im PBS und ihrer umgebenden Wechselwirkungen (insbesondere mit Linkerproteinen) ermöglicht, ermöglicht das Strukturmodell allein keine umfassende Interpretation der excitonischen Kopplung zwischen ihnen benachbarte Chromophore. Das Linkerprotein stabilisiert nicht nur die PBS-Struktur, sondern verändert auch die Absorptions-/Emissionseigenschaften des Chromophors und schafft möglicherweise sogar die notwendige Umgebung für die Exzitonenbindung zwischen Chromophoren29. In dieser Studie schlagen wir den Energieübertragungsweg vor, der auf dem Abstand zwischen Chromophoren und ihrer Ausrichtung auf den Chromophoren basiert, die mit den Linkerproteinen interagieren.

a Mögliche Energieübertragungswege in und zwischen B- und C-Zylindern (C'). b Mögliche Energieübertragungswege in und zwischen A- und C-Zylindern. c Mögliche Energieübertragungswege zwischen A- (A') und B-Zylindern. d–g Die Chromophore und die umgebenden Aminosäurereste von ApcE (LCM). Die Zahlen neben den gestrichelten Linien geben die Abstände (Å) zwischen den PCB-Paaren an. In z. B. zeigen gestrichelte Linien (schwarz und grün) Wasserstoffbrückenbindungen an, und gepunktete Linien (blau) zeigen kovalente Bindungen zwischen PCB und Cysteinresten an. In den Aminosäureresten (Phe992/ApcE und Cys84/C1) in d werden die Richtungen der Atome von Cα nach Cβ in den Resten durch die kapselförmigen Objekte angezeigt. Die Identifizierung von ApcD ist vorläufig und der Chromophor in ApcD (A1αApcD81) ist in Klammern angegeben.

Mit der Übertragungsrate der Anregungsenergie durch den FRET-Mechanismus sind vier Hauptfaktoren verbunden: (i) der Abstand zwischen D und A; (ii) der Orientierungsfaktor κ2, ein Faktor, der die relative Orientierung der Übergangsdipole von D und A im Raum beschreibt (ergänzende Abbildung 11); (iii) das Überlappungsintegral zwischen den Fluoreszenz- und Absorptionsspektren von D bzw. A; und (iv) Quantenausbeute von D in Abwesenheit von A. Für ein frei rotierendes Pigment D und A hat κ2 einen Mittelwert von 2/3, und die Werte von κ2, die die signifikanten Chromophore darstellen, betragen ungefähr 1–3 (Ergänzungstabelle). 6, Ergänzende Abbildungen 11 und 12). Dies weist darauf hin, dass wahrscheinlich ein Energietransfer zwischen ihren Chromophoren im PBS-Kern stattfindet. Der Wirkungsgrad ist durch Dipol-Dipol-Kopplung umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstands zwischen D und A; Je kürzer also der Abstand zwischen den Chromophoren ist, desto größer ist die Geschwindigkeit und Effizienz der Energieübertragung zwischen ihnen. Daher hängt die Effizienz der Energieübertragung zwischen Zylindern auch stark vom Abstand zwischen nahe beieinander liegenden Chromophoren ab.

Die Chromophore im PBS-Kern sind entsprechend der Nomenklatur derjenigen in Rotalgen nummeriert19,20 und ihre Namen sind wie folgt definiert: Zylindername (A, B oder C), Untereinheitstyp (α oder β) und die Nummer des Cysteinrests (84), an den das Chromophor gebunden ist (ergänzende Abbildung 13). Wir wiederholen noch einmal, dass die zuvor beschriebenen Rotalgen-PBS-Strukturen keine C-Zylinder enthalten19,20. Die an der Energieübertragung zwischen oder innerhalb jedes Zylinders beteiligten Chromophore sind in Abb. 3a – c dargestellt. Die Energieübertragung vom C-Zylinder (C') zum B- und A-Zylinder (A') erfolgt über C1α184–B1α284 (33 Å) bzw. C2α384–A2α384 (35 Å) (Abb. 3a, b). In der vorliegenden Struktur bildet der D-Ring von PCB in vielen ApcBs π-π-Wechselwirkungen mit Tyrosinresten (Y90), aber der D-Ring von C1β384 interagiert wahrscheinlich mit Phe992 innerhalb der Schleifenregion (Reste 990–997) von Rep4 im ApcE (Abb. 3d). Darüber hinaus interagiert C1β384 mit S1122/ApcE. Diese Wechselwirkungen tragen wahrscheinlich zur Energieübertragung vom C-Zylinder (C') zum B-Zylinder bei. Im Cyanobakterien-PBS mit gebundenen PC-Stäben (Rt, Rb, Rs1 und Rs2)7,22,26 wird angenommen, dass die von den PC-Stäben empfangene Energie über das C ( C')-Zylinder, was darauf hinweist, dass der C (C')-Zylinder als Vermittler für die Energieübertragung von den PC-Stäben zu den Endemittern fungiert.

Der B-Zylinder besteht aus vier APC-Trimeren, wobei zwei APC-Trimere (B2 und B2') miteinander interagieren. Dies weist darauf hin, dass die Energieübertragung im B-Zylinder durch B2β284–B2'β184 (27 Å), B2β184–B2'β184 (29 Å) und B2β384–B2'β84 (27 Å) vermittelt wird (Abb. 3a). Die Energieübertragung vom B-Zylinder zum A-Zylinder (A') scheint B1'α384–A1αApcD81 (33 Å) und B2α284–A3'α384 (34 Å) zu umfassen (Abb. 3c). Darüber hinaus gibt es eine Wechselwirkung zwischen den A- und A'-Zylindern, was darauf hindeutet, dass die Energieübertragung über A2α284–A3'α384 (32 Å) erfolgt. Diese Chromophore interagieren mit Rep3 und Rep4 von ApcE, und die Aminosäurerestzusammensetzungen von ApcE unterscheiden sich bei jedem der vier Chromophore (C1β384, B2β384, B2β284 und B2β184) (Abb. 3d – g). Drei Chromophore (B2β384, B2β284 und B2β184) interagieren mit Aminosäureresten in Rep3/ApcE und verändern die periphere Struktur jedes Chromophors erheblich. B2β384 bildet Wasserstoffbrücken mit Asparaginresten (N809/ApcE und N835/ApcE) und basische Aminosäuren (R761/ApcE und K890/ApcE) sind in der Nähe von B2β284 vorhanden. B2β184 interagiert mit einem basischen Rest (R730/ApcE) und ist von hydrophoben Aminosäuren (L873/ApcE, T872/ApcE und F878/ApcE) umgeben. Dieser Unterschied in der Proteinumgebung um jedes Chromophor kann sein individuelles Energieniveau bestimmen.

Es wird angenommen, dass drei PCBs im A-Zylinder (A2α384, A2α284 und A3α384) die Schlüsselchromophore sind, die aufgrund ihrer räumlichen Anordnung Anregungsenergie von den B- und C-Zylindern erhalten (Abb. 3b), die sie dann letztendlich an das Chromophor weitergeben (A3αLCM198) in den Endemittern. In diesem Fall wird die Anregungsenergie höchstwahrscheinlich über die vier Chromophore (A2α184, A2β384, A3β184 und A3β284) in der Nähe dieser beiden Chromophore übertragen. Drei der vier Chromophore interagieren mit Rep1 oder Rep2 in einer charakteristischen Struktur (Abb. 4a – c). Der κ2-Wert und der Abstand zwischen den Chromophoren legen auch nahe, dass die Energieübertragungseffizienz von A3αLCM198–A3βApcF82 unter allen identifizierten Paaren am höchsten ist (Ergänzungstabelle 6).

a, b Chromophore im APC-Trimer A3 und ihre Interaktion mit Rep1 von ApcE. c Chromophor im APC-Trimer A2 und seine Wechselwirkung mit Rep2 von ApcE. d Chromophor von ApcF und seine Wechselwirkung mit Rep1 von ApcE. e Chromophor von ApcE und seine Wechselwirkung mit ApcF. Die gestrichelten Linien (schwarz) zeigen Wasserstoffbrückenbindungen an. Die gepunkteten Linien (blau) zeigen kovalente Bindungen zwischen PCB und Cysteinresten an. Aminosäurereste, deren Seitenkettenanordnung nicht genau dargestellt werden kann, werden durch kapselförmige Objekte angezeigt. Die Richtungen der Atome von Cα nach Cβ in den Resten werden durch die kapselförmigen Objekte angezeigt.

A3β184 interagiert mit Y306/ApcE und ist von aromatischen Aminosäuren (Y428/ApcE und F432/ApcE) umgeben. A3β284 interagiert mit S348/ApcE und R366/ApcE, und F373/ApcE befindet sich in der Nähe des D-Rings von A3β284. Darüber hinaus interagiert A2β384 mit R630/ApcE und ist von drei aromatischen Aminosäuren (Y455/ApcE, Y610/ApcE und F637/ApcE) umgeben, wobei F637/ApcE nahe am D-Ring von A2β384 liegt. Es wurde festgestellt, dass in der Struktur von Rotalgen-PBS aromatische Aminosäuren in der Nähe der Chromophore reichlich vorhanden sind, und es wurde vorgeschlagen, dass sie den Energiezustand jedes Chromophors regulieren, um eine unidirektionale Energieübertragung zu erreichen19,20. Die aromatischen Aminosäuren in den Linkerproteinen von T. vulcanus PBS funktionieren möglicherweise ähnlich, was darauf hindeutet, dass die Proteinumgebung um die drei Chromophore für eine effiziente Übertragung der Anregungsenergie auf die beiden Chromophore optimiert ist.

Der Chromophor A3βApcF82 in ApcF bindet C82/ApcF sowie C416/ApcE und interagiert mit vier Aminosäureresten (Y265/ApcE, R84/ApcF, R77/ApcF und R78/ApcF). Diese Wechselwirkung kann dazu beitragen, das Energieniveau von A3βApcF82 anzupassen, um den Energieübertragungsweg von A3βApcF82 zu A3αLCM198 zu bilden. Die Umgebung um A3βApcF82 in ApcF und A3αLCM198 in ApcE könnte eines der entscheidenden Elemente sein, die an der Übertragung der unidirektionalen Anregungsenergie auf PSI und PSII beteiligt sind. Soulier und Bryant berichteten, dass die Wechselwirkungen zwischen PCBs, die an α- und β-Untereinheiten benachbarter APC-Monomere im APC-Trimer gebunden sind, für die Rotverschiebung der Chromophorabsorption verantwortlich sind47. Im PBS von T. vulcanus beträgt der Abstand zwischen A3βApcF82 und A3αLCM198 20 Å, was darauf hindeutet, dass die beiden Chromophore eine excitonische Kopplung bilden könnten, die schließlich Anregungsenergie auf PSI und PSII überträgt. ApcD ist ein terminaler Emitter, der Energie auf PSI überträgt48,49,50, und die Ergebnisse der vorliegenden Studie legen nahe, dass A1αApcD81 eine excitonische Kopplung mit dem benachbarten A1β184 eingeht und Anregungsenergie auf PSI überträgt.

Wir konnten die Seitenketten von drei Aminosäureresten (W166/ApcE, D163/ApcE und K159/ApcE) nicht identifizieren, da die Kryo-EM-Karte um A3αLCM198 etwas ungeordnet war (Abb. 4e und ergänzende Abb. 3e). . Dennoch legt die vorliegende Struktur nahe, dass A3αLCM198 in ApcE eine π-π-Wechselwirkung mit W166/AcpE eingehen könnte, da der D-Ring von PCB und Tyrosinreste in ApcA üblicherweise eine π-π-Wechselwirkung eingehen. Dieser Tryptophan (Trp)-Rest ist im ApcE aller in der ergänzenden Abbildung 9 aufgeführten Spezies konserviert. Tang et al.51 analysierten die Kristallstruktur (PDB-Code: 4XXI) der α-Region im ApcE von Nostoc 7120 und berichteten darüber Die Wechselwirkung dieses Trp mit dem Chromophor ist ein Faktor für die Rotverschiebung bei der Chromophoradsorption. Darüber hinaus ist 4XXI ein Homodimer, und Trp in einem Monomer geht eine π-π-Wechselwirkung mit dem D-Ring des Chromophors ein, während Trp in einem anderen Monomer senkrecht zum D-Ring des Chromophors positioniert ist und eine Kation-π-Wechselwirkung mit dem nahe gelegenen Arg160 bildet (Abb. 5).

eine Kristallstruktur von Nostoc 7120 ApcE bei 2,2 Å Auflösung. b Kryo-EM-Struktur der Rotalge P. purpureum ApcE bei 2,8 Å Auflösung. c Kryo-EM-Struktur der Rotalge G. pacifica ApcE bei 3,5 Å Auflösung. d Kryo-EM-Struktur des Cyanobakteriums Synechococcus 7002 ApcE bei 3,5 Å Auflösung. e Kryo-EM-Struktur des Cyanobakteriums Nostoc ApcE bei 3,9 Å Auflösung. f Kryo-EM-Struktur des Cyanobakteriums T. vulcanus ApcE bei 3,7 Å Auflösung. Diese ApcE-Strukturen wurden überlagert, wobei ihre Dichtekarte bei 1σ (a), 3σ (b), 2σ (c), 5σ (d), 3σ (e) und 3σ (f) konturiert war. Aminosäurereste, deren Seitenkettenanordnung nicht genau dargestellt werden kann, werden durch kapselförmige Objekte angezeigt. Die Richtungen der Atome von Cα nach Cβ in den Resten werden durch die kapselförmigen Objekte angezeigt.

Um zu untersuchen, ob π-π-Wechselwirkungen auch in den durch Kryo-EM19, 20, 22 gelösten PBS-Strukturen gebildet werden, haben wir die α-Region im ApcE der PBS-Strukturen ausgewertet und festgestellt, dass nur P. purpureum PBS klare π-π-Wechselwirkungen aufwies zwischen dem D-Ring des Chromophors und Trp154/ApcE, wohingegen G. pacifica PBS so modelliert wurde, dass es eine π-Kation-Wechselwirkung zwischen dem D-Ring des Chromophors und Arg152/ApcE bildet. Dies ist auf die Qualität der erhaltenen Kryo-EM-Karten zurückzuführen, da die π-π-Wechselwirkungen in den PBS-Strukturen mit Ausnahme der von P. purpureum PBS nicht eindeutig angegeben werden können. Wenn man jedoch bedenkt, dass die π-π-Wechselwirkungen zur Rotverschiebung der Chromophorabsorption beitragen, ist es sehr wahrscheinlich, dass der D-Ring des Chromophors und Trp in allen PBS-Strukturen π-π-Wechselwirkungen ausbilden, was darauf hinweist, dass dieses Merkmal wahrscheinlich wichtig ist Energieübertragung von A3αLCM198 auf PSII. Weitere Details im Hinblick auf A3αLCM198 und wichtige Wechselwirkungen mit umgebenden Strukturen erfordern eine höher aufgelöste Struktur des PBS und/oder eine superkomplexe Struktur, die mit PBS und PSII interagiert. Darüber hinaus zeigten die Aminosäurereste in der Nähe von A3αLCM198 leichte Unterschiede zwischen den Spezies (Abb. 5). Im PBS von T. vulcanus war der Tyr79/ApcF entsprechende Aminosäurerest bei jeder Art Tyr (G. pacifica und P. purpureum), Leu (Nostoc 7120) und Phe (Synechococcus 7002). Dieser Rest befindet sich in einer Entfernung vom Chromophorring, die es unwahrscheinlich macht, dass es zu einer π-π-Wechselwirkung kommt. Es kann jedoch die Absorptionseigenschaft des Chromophors beeinträchtigen, da polare/geladene Aminosäurereste die Absorptionsenergie von Pigmenten beeinflussen40.

Der PC-Stab besteht aus PC-Monomeren, die aus einer α-Untereinheit (CpcA) und einer β-Untereinheit (CpcB) bestehen, um zwei PC-Hexamer zu bilden (Abb. 6a), in denen Linkerproteine interagieren. CpcC, CpcD, CpcG1, CpcG2 und CpcG4 wurden als Linkerproteine des PC in PBSs von T. vulcanus identifiziert (ergänzende Abbildung 2)26, und wir konnten CpcC, CpcD und CpcG2 in der Kryo-EM-Karte des PCs zuordnen PC-Stab (Abb. 6b, c). Da CpcG1, CpcG2 und CpcG4 ähnliche Aminosäuresequenzen aufweisen (ergänzende Abbildung 14), ist die CpcG2-Zuordnung in dieser Studie vorläufig. Wie beobachtet, werden die PC-Stäbe vom vorbereiteten PBS dissoziiert, und somit stellt die erhaltene Kryo-EM-Karte die 3D-Rekonstruktion unter Verwendung von Partikeln in Kombination mit mehreren CpcGs (CpcG1, CpcG2 und CpcG4) dar. Bei der Einzelpartikelanalyse kann die 3D-Klassifizierung zur Klassifizierung fremder und heterogener Partikel eingesetzt werden; Allerdings sind die Gesamtstrukturen von CpcG1, CpcG2 und CpcG4 äußerst ähnlich, was es unmöglich machte, Partikel mit jedem CpcG mit einer Auflösung von 4,2 Å zu klassifizieren.

Wenn im Nostoc 7120 PBS drei CpcG-kodierende Gene (CpcG1, CpcG2 und CpcG4) gelöscht wurden, konnten die PC-Stäbchen nicht an den PBS-Kern binden7. Wenn eines der für CpcG kodierenden Gene gelöscht wurde, konnten die PC-Stäbchen mit dem PBS-Kern interagieren, jedoch nicht auf die gleiche Weise wie das Wildtyp-PBS. Dies legt nahe, dass die Zusammensetzung des CpcG-Proteins in jedem PC-Stab unterschiedlich ist7. Die Kryo-EM-Karte zeigte die Linkerproteine, die von den PC-Stäben ausgehen und mit dem PBS-Kern interagieren. Obwohl die Qualität der Kryo-EM-Karte nicht ausreichte, um ein Strukturmodell zu erstellen, lässt die hohe Identität der Aminosäuresequenzen darauf schließen, dass die Anordnung der CpcGs von T. vulcanus der von Nostoc 7120 ähnelt (ergänzende Abbildung 15)7. 22. Die C-terminale Region des CpcG-Proteins in Rt (Rt') und Rb (Rb') interagiert hauptsächlich mit der peripheren Region des B-Zylinders bzw. der peripheren Region des A-Zylinders (A'). Die C-terminale Region von CpcG interagiert schwach mit den Zylindern des PBS-Kerns und trägt auch einen Stab.

Die Wechselwirkung zwischen PCs und Linkerproteinen im PC-Stab ist asymmetrisch (Abb. 6), was durch die Wechselwirkungen zwischen CpcC, CpcD und CpcG2 im Stab induziert wird. Um zu untersuchen, wie sich der in dieser Studie durch Kryo-EM identifizierte PC-Stab von zuvor beschriebenen PC-Stabstrukturen unterscheidet, haben wir den durch Röntgenkristallographie gelösten PC-Stab überlagert32. Wir haben das Cα-Rückgrat des Polypeptids im PC-Monomer 1 (bestehend aus Kette A und Kette B) mit den entsprechenden in T. vulcanus (3O2C) und Nostoc 7120 (7EYD) überlagert. Anschließend wurden die RMSDs zwischen den anderen PC-Monomeren geschätzt, wobei die gesamte PC-Stabanordnung beibehalten wurde. Obwohl es keine größeren Unterschiede in der Struktur jedes PC-Monomers gab, aus dem die PC-Stäbe bestanden, verursachte die Wechselwirkung der Linkerproteine in den PC-Stäben eine signifikante Verschiebung in der Anordnung von Disk B im PC-Stab.

Die durch Kryo-EM und Röntgenkristallographie gelöste Überlagerung des PC-Stabs (PDB-Code: 3O2C; die PC-Struktur von T. vulcanus) ergab, dass sich die Anordnung der PC-Monomere (Monomere 1–12) im PC-Stab änderte wurde hauptsächlich durch die Wechselwirkung mit Linkerproteinen verursacht (Abb. 7 und Ergänzungstabelle 7). Der RMSD zwischen den Monomeren 1 in Scheibe A (Abb. 7a) ist klein (0,55 Å), wohingegen der zwischen den Monomeren 3 aufgrund der Wechselwirkung zwischen den CpcD-Regionen (Reste 55–65 [rot] und 68–74) groß ist (2,60 Å). [grün]) und CpcB-Regionen (Reste 109–122 [orange]) in Monomer 3 (Abb. 7a). Der RMSD zwischen Monomer 2 ist in Scheibe A am größten (4,06 Å) (Abb. 7a), was darauf hindeutet, dass die Änderung in der Anordnung von Monomer 3 durch die Änderung in der Anordnung von Monomer 2 verursacht wurde, die zur Aufrechterhaltung der Wechselwirkung erforderlich war zwischen den Monomeren 2 und 3. In Scheibe A (Abb. 7b) ist der RMSD zwischen Monomer 4, das sich auf der Unterseite von Monomer 1 befindet, genauso klein wie der der Monomere 1 (0,76 Å) (Abb. 7b). Allerdings sind die RMSDs zwischen den Monomeren 5 und 6 etwas größer (1,49 Å bzw. 1,40 Å), was darauf hindeutet, dass dies auf die Wechselwirkung zwischen den CpcC-Regionen zurückzuführen ist (Reste 123–127 [cyan] und 197–204 [grün] ) und die der Monomere 5 (Reste 14–17 [grün]) und 6 (Reste 113–122 [cyan]).

eine Kryo-EM-Karte des PC-Stabs (Scheibe A und Scheibe B). b Anordnung der Linkerproteine (CpcC, CpcD und CpcG) im PC-Stab. c Struktur des PC-Stabs in b um 90˚ gedreht.

a Überlagerung der oberen Teile von Scheibe A. Das Linkerprotein CpcD (Reste 55–65 [rot in „Panel 1“] und 68–74 [grün in „Panel 1“]) interagiert mit einer CpcB-Region (Reste 109–122). [orange in „Panel 1“]) in PC-Monomer 3. b Überlagerung der unteren Teile von Scheibe A. Das Linkerprotein CpcC (Reste 123–127 [cyan in „Panel 2“] und 197–204 [grün in „Panel 3"]) interagiert mit CpcB-Regionen (Reste 14–17 [grün in "Panel 2"] von PC-Monomer 5 bzw. 113–122 [cyan in "Panel 3"] von PC-Monomer 6). c Überlagerung der oberen Teile von Scheibe B. Die „CpcD-ähnliche Struktur (Reste 234–287)“ in CpcC interagiert mit einer CpcB-Region (Reste 109–122, orange in „Panel 4“) im PC-Monomer 9. Die RMSD der Regionen (Reste 234–287) in CpcC und CpcD beträgt 1,3. d Überlagerung der unteren Teile von Scheibe B. Das Linkerprotein CpcG2 (Reste 9–38 [grün in „Panel 5“]) interagiert mit Regionen in den Monomeren 10 (Reste 78–90 und 109–122 [gelb in „Panel 5“) ]) und 11 (Reste 1–15 und 105–115 [gelb in „Panel 5“]). Die mit „1–5“ gekennzeichneten Bereiche sind die vergrößerte Ansicht der interagierenden Teile der Linkerproteine und jedes PC-Monomers. Helix- und transparente Oberflächenmodelle stellen PC-Stäbe dar, die durch Kryo-EM bzw. Röntgenkristallographie gelöst wurden. Die Felder 1–6 zeigen vergrößerte Ansichten der Wechselwirkungen jedes PC-Trimers mit den Linkerproteinen.

Bemerkenswerterweise ist die Anordnung der Monomere in Scheibe B im Vergleich zu der in den PC-Stäben, die durch Röntgenkristallographie gelöst wurden, erheblich verändert (Abb. 7c, d). Diese große Umlagerung fand auch im PC-Stab Nostoc 7120 statt, was stark darauf hindeutet, dass dies auf die Wechselwirkung der Linkerproteine (CpcC und CpcG) in Scheibe B zurückzuführen ist. Die RMSDs zwischen den Monomeren (7–12) in Scheibe B betragen 21,3 Å , 14,8 Å, 10,6 Å, 11,6 Å, 18,3 Å bzw. 15,4 Å. Scheibe B (Abb. 7c) interagiert mit CpcC und CpcG2, und die „CpcD-ähnliche Struktur (Reste 234–287)“ in CpcC interagiert dabei spezifisch mit der CpcB-Region (Rest 109–122 [orange]) in Monomer 9 Die Wechselwirkung ist der zwischen CpcD und CpcB in Monomer 3 sehr ähnlich. Bei Scheibe B (Abb. 7d) gab es wie bei Scheibe B (Abb. 7c) eine signifikante Änderung in der Anordnung im Vergleich zur Kristallstruktur, nämlich Wechselwirkungen zwischen Resten in der CpcG2-Region (Reste 9–38 [grün]) und den Monomeren 10 (Reste 78–90, 109–122 [gelb]) und 11 (Reste 1–15, 105–115 [gelb]) (Abb. 7d ). Die Linkerproteine tragen zur strukturellen Stabilisierung der PC-Stäbchen bei, und viele Regionen in den Linkerproteinen befinden sich in der Nähe von Chromophoren in den Stäbchen, was darauf hindeutet, dass sie auch zur Feinabstimmung der Energieniveaus dieser Chromophore beitragen.

Darüber hinaus haben wir zum Strukturvergleich den T. vulcanus-PC-Stab und den Nostoc 7120-PC-Stab (Rs1: PC-Stab mit CpcG2) übereinander gelegt (ergänzende Abbildung 16 und ergänzende Tabelle 7). Die Gesamtstrukturen sind sehr ähnlich, wobei sich die Anordnung von Disk A und Disk B im Nostoc 7120 PC-Stab von der in der Kristallstruktur unterscheidet. Dies legt nahe, dass die symmetrischen Wechselwirkungen zwischen dem PC-Trimer in der Kristallstruktur auf die Kristallpackung zurückzuführen sind. Ein Unterschied zwischen den beiden PC-Stäben besteht darin, dass der Nostoc 7120 PC-Stab (Rs1) kein CpcD enthält und die Anordnung des PC-Monomers in der Nähe von CpcD in Scheibe A sich von der des Nostoc 7120 PC-Stabs unterscheidet (RMSD = 2,79). ), was darauf hindeutet, dass diese Änderung in der Anordnung durch die Wechselwirkung zwischen CpcD und CpcB im Monomer 3 von T. vulcanus verursacht wurde.

Die Anordnung der Chromophore, insbesondere an der Grenze zwischen den Scheiben A und B im PC-Stab, unterscheidet sich aufgrund der Wechselwirkung mit den Linkerproteinen von der aus der Kristallpackung der PC-Struktur abgeleiteten Anordnung (Abb. 8). CpcD (LR), eine kleine Stabkappen-Linkerdomäne, ist das äußerste Linkerprotein des intakten PBS, und die Anregungsenergie wird im PC-Stab von Scheibe A auf Scheibe B übertragen. Ähnlich wie beim PBS-Kern trägt die excitonische Kopplung zwischen Chromophoren zur Energieübertragung in den PC-Stäben bei. Diese Wechselwirkung führt zu einem Energietransfer zwischen den PC-Monomeren im PC-Trimer, von β155 zu β84 und von α84 zu β8452. β84s in Disk A und Disk B, die mit CpcC interagieren, befinden sich im PC-Hexamer des PC-Stabs in unmittelbarer Nähe zueinander, was darauf hindeutet, dass die Anregungsenergie über die Chromophore von Disk A auf Disk B im PC-Stab übertragen wird ( β84s) interagieren mit CpcC (Abstände zwischen Chromophoren: 26–27 Å) (Abb. 8). In früheren spektroskopischen Untersuchungen von PC wurde vorgeschlagen, dass β84 in einem PC-Stab, der mit Linkerproteinen interagiert, an der Energieübertragung zwischen PC-Hexameren beteiligt ist52,53,54. Daher sind wahrscheinlich sechs β84 (Abb. 8b) an der Grenze zwischen den Scheiben A und B an der Energieübertragung zwischen den Scheiben beteiligt. Die charakteristischen Aminosäurereste um die Chromophore in den Linkerproteinen und die Wechselwirkungen zwischen diesen Resten und den Chromophoren sind wahrscheinlich entscheidend für die unidirektionale Energieübertragung im PC-Stab.

a Anordnung der Chromophore im PC-Stab. α84, β84 und β155 haben die Farben Cyan, Grün bzw. Gelb. b Anordnung von β84s in einem PC-Stab, der mit Linkerproteinen interagiert. β84s an der Grenze zwischen Disk A und Disk B sind grün gefärbt, und diese Chromophore sind an der Energieübertragung zwischen Disk A und Disk B beteiligt. Die Aminosäurereste der Linkerproteine in der Nähe von β84s sind in B angegeben.

Zusammenfassend ergab die Kryo-EM-Analyse des PBS-Kerns und des PC-Stabs von T. vulcanus (eine hemidiscoide Struktur bei vielen Cyanobakterienarten) die Chromophoranordnung im PBS und seiner umgebenden Struktur. Wir identifizierten drei APC-Trimere im A-Zylinder von T. vulcanus-PBS, die sich von denen unterschieden, die in PBS anderer Cyanobakterienarten beobachtet wurden. Der Grund dafür bleibt unklar und daher sind in Zukunft detaillierte Untersuchungen erforderlich. Der C-Zylinder und seine umgebenden Strukturen in T. vulcanus PBS sowie die Gesamtstruktur von ApcE, einem der Endemitter, waren denen von Nostoc 7120 PBS sehr ähnlich. Insbesondere die Wechselwirkung zwischen dem Chromophor im ApcE und Trp ist hochkonserviert und diese Wechselwirkung ist entscheidend für die Energieübertragung von PBS auf PSII. Allerdings unterscheiden sich die Aminosäurereste rund um das Chromophor geringfügig zwischen den Arten, was darauf hindeutet, dass dies die Unterschiede in der Feinabstimmung des Energieniveaus des Chromophors zwischen den Arten widerspiegelt. Die Gesamtstruktur der durch Kryo-EM analysierten PC-Stäbe unterscheidet sich von den zuvor berichteten Strukturen der PC-Stäbe (insbesondere die Wechselwirkung zwischen den beiden Scheiben), was vermutlich auf die Wechselwirkung mit den Linkerproteinen zurückzuführen ist. Da sich PC-Stäbe leicht vom PBS-Kern lösen, ist es schwierig, die detaillierte Struktur zu klären. Daher ist es notwendig, nicht nur die Struktur des intakten PBS zu analysieren, sondern auch die dissoziierten PC-Stäbchen weiter zu analysieren. Da die Strukturen von PBS je nach Art variieren, bilden Informationen über die PBS-Strukturen eine Grundlage für Studien zur Entwicklung der Photosynthese und zur Vielfalt ihrer Wege. In Zukunft werden wir auf der Grundlage dieser Strukturinformationen Mutations-, spektroskopische und theoretische Studien durchführen, die dazu beitragen werden, unser Verständnis der Funktion von PBS zu vertiefen.

Zellen des thermophilen Cyanobakteriums T. vulcanus NIES-2134 wurden in einem Phosphatmedium55,56 kultiviert. Intakte PBSs und PBS-Kerne wurden gemäß den in Lit. beschriebenen Protokollen hergestellt. 26. Thylakoidmembranen, PSI und PSII wurden gemäß den von Lit. beschriebenen Protokollen hergestellt. 55,56. Bei PC-Stäben wurden die intakten PBS auf einem mit Löchern versehenen, mit Kohlenstofffilm beschichteten Kupfergitter montiert (siehe „Probenvorbereitung und Datenerfassung für Kryo-EM“ für eine Beschreibung der Vorbehandlung des Gitters) und dann eine kleine Menge Puffer 10 mM Phosphatpuffer enthaltend wurde schnell hinzugefügt, um die Phosphatkonzentration in der Probe auf weniger als 0,5 M zu reduzieren. Dies führte zur Dissoziation der PC-Stäbchen von den intakten PBSs.

Die intakten PBS wurden mit 2 % (Gew./Vol.) Uranylacetat auf einem kohlenstoffbeschichteten Gitter 1 Minute lang bei 23 °C angefärbt und die auf dem Gitter verbleibende Lösung vor dem Trocknen entfernt. Die resultierenden Gitter wurden in ein Elektronenmikroskop (JM-2100; JEOL, Tokio, Japan) übertragen, das bei 200 kV betrieben wurde. Die Bilder wurden mit einer Oneview-Kamera (AMETEK, Berwyn, PA, USA) bei einer Nennvergrößerung von 60.000 × (Pixelgröße: 1,90 Å) aufgenommen. Die Datenverarbeitung der negativ gefärbten EM-Bilder wurde mit RELION-3.1.057 durchgeführt. Die Parameter der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) wurden mit CTFFIND4-1.1058 geschätzt und die intakten PBS-Partikel wurden mit Xmipp359, einem referenzfreien Partikelauswahlprogramm, ausgewählt. Insgesamt wurden 9.358 Partikel aus 249 Bildern ausgewählt und der referenzfreien 2D-Klassifizierung mit RELION-3.1.0 unterzogen.

Um die Struktur des PBS-Kerns und des PC-Stabs zu klären, wurden Gitter für Kryo-EM auf folgende Weise vorbereitet. Ein mit einem löchrigen Kohlenstofffilm beschichtetes Kupfergitter (Quantifoil R1.2/1.3 Cu 200 mesh; Microtools GmbH, Berlin, Deutschland), das durch Au-Sputtern vorbehandelt worden war, wurde 10 s lang mit einem Ionenbeschichter (JEC-3000FC; JEOL) glimmentladen , Tokyo, Japan). Für den PBS-Kern wurden 3,0 µL des PBS-Kerns auf das Gitter aufgetragen und 4 s lang mit Filterpapier abgetupft und dann sofort in gekühltem Ethan unter Verwendung eines FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) tauchgefroren. unter 100 % Luftfeuchtigkeit bei 4 °C. Für den PC-Stab wurden 3,5 µL der gereinigten Probe auf das Gitter aufgetragen und mit 1,5 µL 10 mM Phosphatpuffer auf dem Gitter verdünnt. Anschließend wurde das Gitter abgetupft und mit einem selbstgebauten Kolben manuell in gekühltem Ethan eingefroren. Die Gitter wurden dann in ein CRYO ARM 300-Elektronenmikroskop (JEOL) eingeführt, das mit einer Kaltfeld-Emissionskanone und einem säuleninternen Energiefilter mit einer Spaltbreite von 20 eV ausgestattet war. Dosisfraktionierte Bilder wurden mit einem K2-Gipfel-Direktelektronendetektor (AMETEK, Berwyn, PA, USA) im Zählmodus aufgezeichnet. Alle Bilder wurden mit einem automatischen Datenerfassungssystem von JEOL60 mit einer nominellen Vergrößerung von 40.000-fach korrigiert, was einer Pixelgröße von 1,24 Å entsprach. Die nominellen Defokusbereiche und Dosisraten für den PBS-Kern und den PC-Stab betrugen −0,5 µm bis −1,5 µm und 84,1 e−Å−2 mit 50 Bildern bzw. −0,5 µm bis −1,5 µm und 50,5 e−Å−2 mit 30 Bildern . Insgesamt haben wir 4600 bzw. 2865 Filme für den PBS-Kern und den PC-Stab gesammelt.

Die gesammelten Filmstapel des PBS-Kerns wurden in acht Optikgruppen unterteilt, um Änderungen der Strahlneigung im Laufe der Zeit zu korrigieren. Driftkorrektur und dosisgewichtete Bildsummierung wurden mit MotionCor2-1.3.261 durchgeführt und CTF-Parameter wurden mit CTFFIND4-1.1058 geschätzt. Die Bilder wurden für die weitere Datenverarbeitung basierend auf den Thon-Ringmustern ausgewählt. Die PBS-Kernpartikel wurden manuell ausgewählt und einer referenzfreien 2D-Klassifizierung durch RELION-3.1.057 unterzogen, um Referenzbilder für die automatische Partikelauswahl zu erstellen. Insgesamt wurden 128.676 Partikel automatisch ausgewählt und mit einer Pixelgröße von 2,48 Å extrahiert. Gute gemittelte Klassen mit 45.427 Partikeln nach der 2D-Klassifizierung wurden einer dreidimensionalen (3D) Ab-initio-Rekonstruktion in cryoSPARC-2.12.062 unterzogen. Nach der 3D-Klassifizierung in RELION wurde eine gut ausgerichtete 3D-Klasse mit 25.532 Partikeln mit einer Pixelgröße von 1,24 Å extrahiert und für die weitere 3D-Verfeinerung mit zweifacher Symmetrieerzwingung verwendet. Die Nachbearbeitung in RELION ergab eine Karte mit einer Auflösung von 4,75 Å basierend auf dem Goldstandard FSC. Nach zwei Runden Bayes'scher Politur und CTF-Verfeinerung erreichte die Auflösung schließlich 3,71 Å.

Für PC12mer wurden alle Filmstapel mit MotionCor2-1.2.1 und Gctf-1.0663 zur Driftkorrektur, Bildsummierung und CTF-Parameterschätzung verarbeitet. Die 812.327 Partikel wurden durch Convolutional Neural Network Picking mit EMAN-2.3.164 ausgewählt und während der Extraktion mit RELION-3.0 auf eine Pixelgröße von 4,96 Å gruppiert. Nach zwei Runden der 2D-Klassifizierung wurden 309.291 Partikel ausgewählt und einer Ab-initio-Modellkonstruktion mit cisTEM-1.0.0 beta65 unterzogen. Gute Partikel wurden mit EMAN-2.3.1 automatisch erneut mit einer 3D-Referenz ausgewählt. Insgesamt wurden 159.537 Partikel mit einer Pixelgröße von 1,86 Å aus 1.022.349 ausgewählten Partikeln basierend auf 2D- und 3D-Klassifizierungen ausgewählt. Es wurde eine 3D-Verfeinerung mit RELION-3.0 durchgeführt, und nach Bayes'scher Politur verbesserten CTF-Verfeinerung und zusätzliche 3D-Klassifizierung die Auflösung auf 4,19 Å mit 111.054 Partikeln ohne jegliche Symmetrieerzwingung. Weitere Einzelheiten finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. 4, 5 und Ergänzungstabelle 1.

Erste Modelle des PBS-Kerns und des PC-Stabs von T. vulcanus wurden unter Verwendung von Referenzmodellen von PC und APC (PDB-Codes: 3O18 und 3DBJ) erstellt und die Homologiemodellierung wurde auf dem SWISS-MODEL-Server (https://swissmodel.expasy) durchgeführt. org/) durch Bezugnahme auf die Strukturen der Linkerproteine (PDB-Codes: 5Y6P und 6KGX). Die erhaltenen Modelle wurden mithilfe des Programms „Fit in Map“ in UCSF Chimera (Version 1.13) mit den Kryo-EM-Karten angepasst und erste Modelle des PBS-Kerns und des PC-Stabs erstellt. Die ursprünglichen Modelle wurden manuell mit COOT modifiziert, um sie an die Kryo-EM-Karte anzupassen, und mit Phenix (Version 1.19.2) verfeinert. Anschließend wurden jede Untereinheit und ihre interagierenden Untereinheiten im PBS-Kern und PC-Stab mithilfe von REFMAC5 (Version 5.8.0267) in CCP-EM gruppiert und anhand der Kryo-EM-Karte verfeinert. Schließlich wurden die gruppierten Modelle zu einem zusammengeführt und die Gesamtstrukturen (PBS-Kern und PC-Stab) mit Phenix verfeinert. Die Verfeinerungsstatistiken der verfeinerten Modelle wurden mithilfe des umfassenden Validierungsprogramms in Phenix ermittelt. Die für die Liganden im PBS-Kern und im PC-Stab von T. vulcanus erforderlichen Beschränkungen wurden mit dem elektronischen Ligand Bond Builder und der Optimization Workbench66 generiert. Die Beschränkungsinformationen für ein methyliertes Asn (Ligand-ID: MEN) und Phycocyanobilin (Ligand-ID: CYC) wurden aus dem MEN-Modell erhalten, das in einer hochauflösenden Kristallstruktur identifiziert wurde (PDB-Code: 3O18). Umfassende Validierung (in Phenix), Q-Score39 und FSC-Q67 wurden verwendet, um die verfeinerten Strukturmodelle (PBS-Kern und PC-Stab) zu validieren.

Basierend auf der Anordnung der PCBs und ihrer Ausrichtung im konstruierten PBS-Kern wurde ein ungefährer Orientierungsfaktor κ2 geschätzt (Ergänzungstabelle 6). Diese Schätzungen wurden insbesondere für die Stellen durchgeführt, die wahrscheinlich an der Energieübertragung zwischen Zylindern im PBS-Kern beteiligt sind, und für die Endemitter. Die Anregungsenergieübertragungsrate (kEET) wird durch Gl. (1), wobei V und Θ der elektronische Kopplungsfaktor bzw. das Überlappungsintegral sind.

Wie in der ergänzenden Abbildung 11 (a) gezeigt, beträgt das Übergangsdipolmoment von Donor (D) und Akzeptor (A) μD bzw. μA. r ist der intermolekulare Mittelpunkt-zu-Mittelpunkt-Abstand zwischen D und A. V wird durch die Näherungsgleichung geschrieben [Gl. (2) und (3)], und der Orientierungsfaktor (κ2) kann durch Gleichung geschätzt werden. (4).

Die Ausrichtung des Übergangsdipolmoments von PCBs wurde unter Bezugnahme auf Lit. bestimmt. 68 (Ergänzende Abbildungen 11 und 12).

Absorptionsspektren der Thylakoidmembran, PSII, PSII und PBS wurden bei 23 °C mit einem UV-2600-Spektrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) gemessen. Das Spektrum der Thylakoidmembran wurde mit der Opalglas-Methode gemessen.

Mit Dithiothreitol denaturierte Polypeptide wurden auf einem SuperSep-Gel mit 10–20 % Acrylamid (Wako, Tokio, Japan) aufgetrennt und dann mit Coomassie Blue angefärbt (ergänzende Abbildung 2c). Zum Fotografieren der gefärbten Gele wurde ein Gelbildgebungssystem (ChemiDoc XRS + System; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) verwendet. Getrennte Polypeptide (eine Bande, die ApcC und CpcD enthält) wurden durch MS identifiziert. Die erhaltenen Proteinbanden wurden durch In-situ-Verdau mit Trypsin69 behandelt. Die fragmentierten Peptide wurden durch Peptid-Massen-Fingerprinting und MS/MS unter Verwendung von Autoflex Speed (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland) analysiert. Die erhaltenen Massenspektren wurden mit dem MASCOT-Server (Matrix Science Inc., Boston, MA, USA) analysiert.

Achtunddreißig Sequenzen von ApcE aus ausgewählten Stämmen von Cyanobakterien, Glaukophyten und Rhodophyten wurden mit dem Blastp-Programm auf der NCBI-Website (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) erhalten (Ergänzende Abbildungen 8 und ). 9). Die Sequenzen wurden mit mafft (v.7.478) mit der L-INS-i-Option70 abgeglichen. Der Maximum-Likelihood-Baum der ApcE-Sequenzen wurde mit iqtree2 (v.2.1.4) mit dem von ModelFinder ausgewählten LG + F + R5-Modell geschätzt. Die statistische Unterstützung der Bäume wurde mit 1.000 Replikationen der ultraschnellen Bootstrap-Näherung71 geschätzt. Die Domänenorganisation von ApcE wurde mithilfe des hmmscan-Programms in HMMER (v.3.3.2; http://hmmer.org/) mit der Pfam-Datenbank72 bestimmt. Der phylogenetische Baum und die Domänenorganisation wurden mit iToL (v.473) visualisiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Atomkoordinaten und Kryo-EM-Karten für die berichtete Struktur des PBS-Kerns und des PC-Stabs von Thermosynechococcus vulcanus wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 7VEA (PBS-Kern) und 7VEB (PC-Stab) sowie in der Elektronenmikroskopie-Datenbank hinterlegt unter den Zugangscodes EMD-31944 (PBS-Kern) bzw. EMD-31945 (PC-Stab). Die in dieser Studie erstellten Grafiken und Zahlen sind in der Datei „Zusätzliche Informationen/Quelldaten“ enthalten. Weitere Daten sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken den Forschungsassistenten Frau Yuko Kageyama (Biostructural Mechanism Laboratory, RIKEN SPring-8 Center) und Frau Rie Uno (Osaka Metropolitan University) für ihre Hilfe bei Zellkulturen, Probenvorbereitung, Elektrophoreseanalyse und Spektroskopie. Wir danken auch Frau Tomomi Shimonaka von der Graduate School of Science der Osaka City University für die Durchführung der MS/MS-Spektrometrie. Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (JP20H05109 (an KK), JP20K06528 (an KK) und JP17H06434 (an NK)) und teilweise durch die Joint Usage/Research des Institute of Industrial Nanomaterials unterstützt. Kumamoto-Universität. JST-Mirai-Programm-Zuschussnummer JPMJMI20G5 (an KY) und Cyclic Innovation for Clinical Empowerment (CiCLE) der japanischen Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED (an KK, TH und KY).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Keisuke Kawakami, Tasuku Hamaguchi.

Labor für biostrukturelle Mechanismen, RIKEN SPring-8 Center, 1-1-1, Sayo, Hyogo, 679-5148, Japan

Keisuke Kawakami, Tasuku Hamaguchi und Koji Yonekura

Von der Elektronik inspiriertes interdisziplinäres Forschungsinstitut, Toyohashi University of Technology, 1-1 Tempaku, Toyohashi, Aichi, 441-8580, Japan

Yuu Hirose

Institut für industrielle Nanomaterialien, Universität Kumamoto, Kumamoto, 860-8555, Japan

Daisuke Kosumi

Graduate School of Science, Osaka Metropolitan University, Osaka, 558-8585, Japan

Makoto Miyata

Das OCU Advanced Research Institute for Natural Science & Technology (OCARINA), Osaka Metropolitan University, Osaka, 558-8585, Japan

Nobuo Kamiya

Advanced Electron Microscope Development Unit, RIKEN-JEOL Collaboration Center, RIKEN Baton Zone Program, Hyogo, 679-5148, Japan

Koji Yonekura

Institut für multidisziplinäre Forschung für fortgeschrittene Materialien, Tohoku-Universität, Miyagi, 980-8577, Japan

Koji Yonekura

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KK und NK haben die Studie entworfen; KK bereitete die Proben vor und führte eine Elektrophoreseanalyse durch; KK führte spektroskopische Messungen durch, KK führte die Messung und Analyse des negativ färbenden EM durch; TH hat EM-Mikroaufnahmen gemessen, und TH und KK haben die EM-Daten verarbeitet (PBS-Kern: TH; PC-Stab: KK) und die endgültige EM-Karte rekonstruiert (PBS-Kern: TH; PC-Stab: KK); KK führte eine Strukturanalyse durch; YH führte eine phylogenetische Baumanalyse durch; DK äußerte sich zu den Datenanalysen; KY, NK und MM überwachten das Projekt; KK, TH und KY haben den Manuskriptentwurf geschrieben; KK, TH und KY überarbeiteten das endgültige Manuskript; und alle Autoren trugen zur Interpretation der Ergebnisse und zur Verbesserung des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Keisuke Kawakami oder Koji Yonekura.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Noam Adir, Florent Waltz und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kawakami, K., Hamaguchi, T., Hirose, Y. et al. Kern- und Stäbchenstrukturen eines thermophilen, cyanobakteriellen, lichtsammelnden Phycobilisoms. Nat Commun 13, 3389 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30962-9

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Eingegangen: 28. Oktober 2021

Angenommen: 24. Mai 2022

Veröffentlicht: 17. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30962-9

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Zeitschrift für Angewandte Phykologie (2023)

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Kern- und Stäbchenstrukturen eines thermophilen Cyanobakteriums